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Die Immunmarkierung auch Immun oder Antikörperfärbung genannt ist eine biochemische Methode zum Nachweis eines Moleküls
Antikörperfärbung
Die Immunmarkierung (auch Immun- oder Antikörperfärbung genannt) ist eine biochemische Methode zum Nachweis eines Moleküls durch Bindung eines Immunkonjugates.
Eigenschaften
Die Immunmarkierung ist eine Methode zur Molekülmarkierung und verwendet dabei mit einem Nachweissystem markierte Antikörper oder -Fragmente. Eine Immunmarkierung verwendet für den Nachweis Biotin, Radioisotope, Reporterenzyme, Oligonukleotide oder Fluorophore als Signalmolekül (Reporter), das zum Nachweis dient. Der Nachweis beruht auf der Affinität von Antikörpern zu einer bestimmten Gewebeeigenschaft (Epitop) als Antigen-Antikörper-Reaktion. Im Idealfall kommt es zu einer spezifischen und starken Bindung zwischen Antikörper und Epitop. Der Antikörper ist mit einem Detektionssystem gekoppelt, das sein Vorhandensein im Präparat sichtbar macht. Mittels verschiedener Detektionssysteme können schon geringe Mengen an Epitop verstärkt dargestellt werden. Das Ziel ist es, ein Signal am Ort des Epitops (und nur dort) in ausreichender Stärke zu erkennen.
Der Antikörper, der gegen das zu findende Epitop gerichtet ist, wird als Primärantikörper bezeichnet. Der Antikörper sollte sich durch hohe Spezifität und Affinität auszeichnen und keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen zeigen. In einem Mehrschrittverfahren werden die einzelnen Komponenten des Detektionssystems dem Präparat zugeführt. Deshalb ist die Immunhistochemie (IHC) relativ langwierig und fehleranfällig. Das Ergebnis ist auch beeinflussbar durch Fixierungsart, Fixierungsdauer, Einbettungsmethoden, Vorbehandlungsmethoden (Antigen-Retrieval) der Präparate etc. Eine Standardisierung der Testdurchführung sollte daher angestrebt werden. Die Antigen-Antikörper-Reaktion ist abhängig von Temperatur, Konzentration, Inkubationszeit, Agitation und dem optimalen Reaktionsmilieu (pH-Wert, Salzkonzentrationen). Als Puffer für die Bindung von Antikörpern oder Immunkonjugaten wird meistens TBS-T-Puffer verwendet.
Um diese Variablen möglichst konstant zu halten und das große Probenvolumen im Labor bearbeiten zu können, wurden IHC-Automaten unterschiedlicher Bauart eingeführt. Die Beurteilung der Immunhistochemie erfolgt immer im morphologischen Kontext. Hinderlich können sich dabei unspezifische Reaktionen und allgemeine Hintergrundfärbungen (endogene Peroxidase, endogenes Biotin) erweisen. Ist nur ein schwaches Signal nachweisbar, lässt es sich durch verschiedene Methoden (z. B. TSA) verstärken (Signal-Amplifikation).
Direkte Methode
Das zu untersuchende Antigen (=Protein) wird unter definierten Bedingungen mit einem spezifischen Antikörper zusammengebracht, der direkt mit einem Enzym oder Fluorophor wie Fluorescein, Rhodamin oder Texas Red gekoppelt (konjugiert) ist. Der Antikörper (und somit das Enzym) bindet an das Antigen, nicht gebundener Antikörper wird abgespült. Dem Enzym wird in einem weiteren Schritt ein Substrat angeboten, das unter Bildung eines Farbstoffs mit dem Enzym reagiert. Dieser Farbstoff bildet sich dort, wo die immunchemische Reaktion stattgefunden hat und ist sichtbar. Einfach ausgedrückt: Antigen + Antikörper mit Enzym + Substrat/Chromogen → Farbe
Bei fluorochrom-markierten Antikörpern erfolgt die Detektion direkt im Fluoreszenzmikroskop. Die direkte Immunfluoreszenz (DIF) eignet sich auch gut zu Mehrfachdarstellungen unterschiedlicher Antigene in einem Präparat, hierbei werden Antikörper unterschiedlicher Spezifität mit Fluorochromen unterschiedlicher Emissionswellenlängen konjugiert. Die DIF stellt die älteste immunhistochemische Technik dar und wurde das erste Mal in den 50er Jahren angewandt.
Indirekte Methode
Bei dieser auch als indirekte Immunfluoreszenz (IIF) bezeichneten Methode wird im ersten Schritt ein spezifischer Antikörper (Primärantikörper) auf das zu untersuchende Gewebe/Zellen aufgebracht. In einem zweiten Schritt wird ein Antikörper aufgetragen, der sich gegen den ersten Antikörper richtet. Es ist der sog. Sekundärantikörper, der hier mit einem Enzym gekoppelt ist und die Farbentstehung mit einer Enzym-Substrat-Reaktion auslöst. Wieder entsteht ein sichtbarer Farbstoff.
Einfach: Antigen + Primärantikörper + Sekundärantikörper mit Enzym + Substrat/Chromogen → Farbe
Die indirekte Methode gibt es als Zwei-Schritt-Methode und als Drei-Schritt-Methode. Bei der Drei-Schritt-Methode wird ein weiterer, mit einem Enzym gekoppelter, Antikörper (=Tertiärantikörper) zugegeben. Dieser bindet an den Sekundärantikörper. Dieser Schritt dient der Signalverstärkung und ist sinnvoll, wenn eine geringe Menge an Epitop dargestellt werden soll.
Die indirekte Technik wird auch zum Nachweis von bereits gebundenen endogenen Antikörpern, beispielsweise Autoantikörpern wie Anti-Neutrophile cytoplasmatische Antikörper (ANCA) angewendet; bzw. enthält das zu untersuchende Patienten-Serum diese Autoantikörper und wird auf Testgewebe aufgetragen. Bei einem positiven Resultat findet der Sekundärantikörper (hier typischerweise mit einem Fluorochrom gekoppelt) seinen Bindungspartner.
PAP- und APAAP-Methode
Diese Methoden haben ihren Namen vom Peroxidase-Anti-Peroxidase (Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode) oder Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Komplex, der hier nach dem Sekundär-AK aufgetragen wird. Der Komplex besteht aus drei Molekülen Enzym und zwei Antikörpern (aus derselben Spezies wie Primär-AK), die gegen das Enzym gerichtet sind. Der Sekundär-AK fungiert als Brücke zwischen Primär-AK und PAP-Komplex. Diese Methode zeigte erhöhte Sensitivität und geringere Hintergrundanfärbung als die Vorgänger-Methoden und wurde als „Kit“ zur routinemäßigen Verwendung in den 80er Jahren in den Labors eingeführt.
Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode (LSAB)
Heutzutage ist diese Färbemethode die am meisten eingesetzte. Das Prinzip basiert auf der hohen Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii) und Avidin (Hühnereiweiß) für Biotin. Streptavidin und Avidin besitzen jeweils vier Bindungsstellen für Biotin.
Die Reihenfolge der Reagenzien: Unkonjugierter Primärantikörper + biotinmarkierter (=biotinylierter) Sekundärantikörper + Avidin-Biotin-Enzymkonjugat + Substrat/Chromogen → Farbe.
Polymer-Methoden
Hier wird der Primär AK (direkte M.) bzw. der Sekundär AK (indirekte M.) mit einem oder mehreren Polymer-Molekülen (Dextran oder Polypeptid) bestückt. Diese Polymere sind markiert mit möglichst viel Enzym, das wiederum Substrat- und Chromogenumsetzung bewirkt. Somit erreicht man eine verstärkte Anfärbung am Ort des Antigens. Der Vorteil liegt darin, kein Biotin verwenden zu müssen, das als "endogenes Biotin" Hintergrundfärbung verursachen könnte. Die Methode ist meist sensitiver und schneller als LSAB. Der Nachteil liegt in der Molekülgröße, die ins Gewebe gebracht werden muss und zu sterischen Behinderungen am Bindungsort führen kann.
Doppelimmunmarkierung
Eine Doppelimmunmarkierung oder Doppelimmunfärbung bezeichnet die Sichtbarmachung zweier Epitope auf einer Untersuchungsprobe durch Verwendung zweier Antikörper oder Immunkonjugate. Als Immunkonjugate werden meistens Reporterenzyme, radioaktive Isotope (kurzlebige α- oder β-Strahler), Kolloide von Edelmetallen oder Fluorophore direkt über heterobifunktionelle Vernetzer an die Antikörper gekoppelt.
Die Probe kann z. B. ein Western Blot, Zellen für eine Durchflusszytometrie, ein transmissionselektronenmikroskopisches Präparat oder ein immunhistochemisch oder durch Immunfluoreszenz gefärbter Dünnschnitt sein. Die Doppelmarkierung wird auch im Zuge einer virologischen Diagnostik eingesetzt.
Direkte Färbung
Zur Doppelimmunfärbung wird zuerst die Probe mit den beiden, gegen zwei verschiedene Epitope gerichteten Antikörpern inkubiert. Werden die Antikörper gegen diese Epitope mit jeweils einem Reporterenzym gekoppelt, spricht man von einer direkten Markierung. Bei einer indirekten Markierung werden die gegen die gesuchten Epitope gerichteten Antikörper als Primärantikörper bezeichnet, da anschließend Immunkonjugate verwendet werden.
Indirekte Färbung
Bei einer indirekten Markierung über Primärantikörper und Immunkonjugat sind je ein zusätzlicher Waschschritt und eine Immunkonjugat-Inkubation notwendig. Dafür erfolgt eine Signalverstärkung durch die Verwendung eines Immunkonjugats, das gegen mehrere Epitope auf dem F(c)-Fragment des Antikörpers gerichtet ist, wodurch viele Reportermoleküle am Primärantikörper gruppiert werden. Zudem können die Immunkonjugate modular gegen alle Primärantikörper einer Art verwendet werden, was eine Kopplung jedes Primärantikörpers mit einem Reportermolekül vermeidet und damit Kosten reduziert. Werden zwei verschiedene indirekte Färbungen (mit getrenntem Primärantikörper und Immunkonjugaten mit Reporterenzymen) gleichzeitig verwendet, werden zur Unterscheidung der beiden Signale zwei Primärantikörper aus zwei verschiedenen Arten verwendet, bei denen die Immunkonjugate nicht kreuzreagieren. Dabei werden meistens unterschiedliche Reporterenzyme verwendet. Ebenso kann eine serielle Doppelimmunfärbung jedoch auch ausschließlich mit Peroxidase-Konjugaten erfolgen, in dem nach einer ersten Färbung die Peroxidase mit verdünnten Natriumazidlösungen inaktiviert wird und anschließend das ungebundene Natriumazid herausgewaschen und erneut mit einem Peroxidase-Konjugat gefärbt wird.
Reporterenzyme
Als Reporterenzyme werden z. B. die Meerrettichperoxidase (mit TMB, DAB, ABTS, AEC oder – in Form einer Chemolumineszenz – mit Luminol) und die Alkalische Phosphatase (mit BCIP und NBT oder mit Naphthol-AS-MX-Phosphat und Fast Red TR) eingesetzt. Die unterschiedlichen präzipitierenden Farbreaktionen werden seriell durchgeführt.
Fluorophore
Bei fluoreszenten Mehrfachmarkierungen werden die Fluorophore so ausgewählt, dass die Bereiche der Anregungs- und Abstrahlungswellenlängen möglichst weit auseinanderliegen. Dadurch wird ein übermäßiges Überstrahlen der Fluoreszenz in andere Farbkanäle des Fluoreszenzdetektors und die damit notwendige Fluoreszenzkompensation gemindert, welche zu Verlusten der führt und so die Nachweisgrenze anhebt.
Reportersysteme
Die verschiedenen Farbstoffe unterscheiden sich unter anderem in ihrer Farbe und Löslichkeit. Lösliche Farbstoffe werden bevorzugt bei einem ELISA eingesetzt, während bei der Immunhistochemie und dem Western Blot meist präzipitierende Farbstoffe verwendet werden.
Peroxidase (POD, Horseradish peroxidase HRP)
Der Peroxidase (meist der Meerrettichperoxidase) wird Wasserstoffperoxid als Substrat angeboten. Die freiwerdenden Protonen oxidieren das vorher fast farblose Chromogen zu seinem farbigen Endprodukt unter Bildung von Wasser.
- ABTS
- AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol) bildet ein rosenrotes Endprodukt
- CN (4-Chlor-1-naphthol) reagiert unter Bildung eines blauen Farbstoffs
- DAB (3,3′-Diaminobenzidin) bildet ein braunes Endprodukt
- Luminol und andere Dioxetane reagieren unter Bildung von Chemolumineszenz mit folgender Autoradiographie
- TMB (Tetramethylbenzidin) bildet ein blaues Endprodukt, welches beim Abstoppen der Reaktion mit Schwefelsäure einen stabilen gelben Farbkomplex bildet
Alkalische Phosphatase (AP)
Der alkalischen Phosphatase werden organische Phosphatverbindungen als Substrat angeboten. Die AP spaltet Phosphat ab und die freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen Endprodukt.
- 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) wird in Verbindung mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) zu einem violetten bis blauen Farbstoff umgesetzt: Das Tetrazolium-Salz oxidiert Indoxyl zum blauen Indigo-Farbstoff. Dabei wird das Tetrazoliumsalz reduziert zum blauen Formazan-Farbstoff.
- Naphthol-AS-MX-Phosphat bildet einen roten Farbstoff: Naphthol AS reagiert mit Fast Red TR zu einem unlöslichen Azofarbstoff.
- Neufuchsin liefert ein rosa rotes Reaktionsprodukt
Radioisotope
Radioisotope werden im Zuge einer Molekülmarkierung an Antikörper gekoppelt und nach einer Proteinreinigung per Autoradiographie oder per Szintillationszähler registriert.
- 131Iod
- 32Phosphor
- 3Tritium
Siehe auch
- In-situ-Hybridisierung
Literatur
- Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 3-8274-0041-4.
- Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3-8274-2312-2.
Einzelnachweise
- R. Lequin: Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In: Clin. Chem. Band 51, Nr. 12, 2005, S. 2415–2418, doi:10.1373/clinchem.2005.051532, PMID 16179424.
Autor: www.NiNa.Az
Veröffentlichungsdatum:
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Die Immunmarkierung auch Immun oder Antikorperfarbung genannt ist eine biochemische Methode zum Nachweis eines Molekuls durch Bindung eines Immunkonjugates EigenschaftenDie Immunmarkierung ist eine Methode zur Molekulmarkierung und verwendet dabei mit einem Nachweissystem markierte Antikorper oder Fragmente Eine Immunmarkierung verwendet fur den Nachweis Biotin Radioisotope Reporterenzyme Oligonukleotide oder Fluorophore als Signalmolekul Reporter das zum Nachweis dient Der Nachweis beruht auf der Affinitat von Antikorpern zu einer bestimmten Gewebeeigenschaft Epitop als Antigen Antikorper Reaktion Im Idealfall kommt es zu einer spezifischen und starken Bindung zwischen Antikorper und Epitop Der Antikorper ist mit einem Detektionssystem gekoppelt das sein Vorhandensein im Praparat sichtbar macht Mittels verschiedener Detektionssysteme konnen schon geringe Mengen an Epitop verstarkt dargestellt werden Das Ziel ist es ein Signal am Ort des Epitops und nur dort in ausreichender Starke zu erkennen Der Antikorper der gegen das zu findende Epitop gerichtet ist wird als Primarantikorper bezeichnet Der Antikorper sollte sich durch hohe Spezifitat und Affinitat auszeichnen und keine Kreuzreaktionen mit ahnlichen Epitopen zeigen In einem Mehrschrittverfahren werden die einzelnen Komponenten des Detektionssystems dem Praparat zugefuhrt Deshalb ist die Immunhistochemie IHC relativ langwierig und fehleranfallig Das Ergebnis ist auch beeinflussbar durch Fixierungsart Fixierungsdauer Einbettungsmethoden Vorbehandlungsmethoden Antigen Retrieval der Praparate etc Eine Standardisierung der Testdurchfuhrung sollte daher angestrebt werden Die Antigen Antikorper Reaktion ist abhangig von Temperatur Konzentration Inkubationszeit Agitation und dem optimalen Reaktionsmilieu pH Wert Salzkonzentrationen Als Puffer fur die Bindung von Antikorpern oder Immunkonjugaten wird meistens TBS T Puffer verwendet Um diese Variablen moglichst konstant zu halten und das grosse Probenvolumen im Labor bearbeiten zu konnen wurden IHC Automaten unterschiedlicher Bauart eingefuhrt Die Beurteilung der Immunhistochemie erfolgt immer im morphologischen Kontext Hinderlich konnen sich dabei unspezifische Reaktionen und allgemeine Hintergrundfarbungen endogene Peroxidase endogenes Biotin erweisen Ist nur ein schwaches Signal nachweisbar lasst es sich durch verschiedene Methoden z B TSA verstarken Signal Amplifikation Direkte Methode Immunhistochemie direkte Methode Das zu untersuchende Antigen Protein wird unter definierten Bedingungen mit einem spezifischen Antikorper zusammengebracht der direkt mit einem Enzym oder Fluorophor wie Fluorescein Rhodamin oder Texas Red gekoppelt konjugiert ist Der Antikorper und somit das Enzym bindet an das Antigen nicht gebundener Antikorper wird abgespult Dem Enzym wird in einem weiteren Schritt ein Substrat angeboten das unter Bildung eines Farbstoffs mit dem Enzym reagiert Dieser Farbstoff bildet sich dort wo die immunchemische Reaktion stattgefunden hat und ist sichtbar Einfach ausgedruckt Antigen Antikorper mit Enzym Substrat Chromogen Farbe Bei fluorochrom markierten Antikorpern erfolgt die Detektion direkt im Fluoreszenzmikroskop Die direkte Immunfluoreszenz DIF eignet sich auch gut zu Mehrfachdarstellungen unterschiedlicher Antigene in einem Praparat hierbei werden Antikorper unterschiedlicher Spezifitat mit Fluorochromen unterschiedlicher Emissionswellenlangen konjugiert Die DIF stellt die alteste immunhistochemische Technik dar und wurde das erste Mal in den 50er Jahren angewandt Indirekte Methode Immunhistochemie Indirekte Methode Immunfluoreszenzaufnahme der Replikationskomplexe von BVDV Der an den Primarantikorper gebundene und mit einem Enzym gekoppelte Sekundarantikorper erscheint rot Indirekte Methode Bei dieser auch als indirekte Immunfluoreszenz IIF bezeichneten Methode wird im ersten Schritt ein spezifischer Antikorper Primarantikorper auf das zu untersuchende Gewebe Zellen aufgebracht In einem zweiten Schritt wird ein Antikorper aufgetragen der sich gegen den ersten Antikorper richtet Es ist der sog Sekundarantikorper der hier mit einem Enzym gekoppelt ist und die Farbentstehung mit einer Enzym Substrat Reaktion auslost Wieder entsteht ein sichtbarer Farbstoff Einfach Antigen Primarantikorper Sekundarantikorper mit Enzym Substrat Chromogen Farbe Die indirekte Methode gibt es als Zwei Schritt Methode und als Drei Schritt Methode Bei der Drei Schritt Methode wird ein weiterer mit einem Enzym gekoppelter Antikorper Tertiarantikorper zugegeben Dieser bindet an den Sekundarantikorper Dieser Schritt dient der Signalverstarkung und ist sinnvoll wenn eine geringe Menge an Epitop dargestellt werden soll Die indirekte Technik wird auch zum Nachweis von bereits gebundenen endogenen Antikorpern beispielsweise Autoantikorpern wie Anti Neutrophile cytoplasmatische Antikorper ANCA angewendet bzw enthalt das zu untersuchende Patienten Serum diese Autoantikorper und wird auf Testgewebe aufgetragen Bei einem positiven Resultat findet der Sekundarantikorper hier typischerweise mit einem Fluorochrom gekoppelt seinen Bindungspartner PAP und APAAP Methode Diese Methoden haben ihren Namen vom Peroxidase Anti Peroxidase Peroxidase Anti Peroxidase Methode oder Alkalische Phosphatase Anti Alkalische Phosphatase Komplex der hier nach dem Sekundar AK aufgetragen wird Der Komplex besteht aus drei Molekulen Enzym und zwei Antikorpern aus derselben Spezies wie Primar AK die gegen das Enzym gerichtet sind Der Sekundar AK fungiert als Brucke zwischen Primar AK und PAP Komplex Diese Methode zeigte erhohte Sensitivitat und geringere Hintergrundanfarbung als die Vorganger Methoden und wurde als Kit zur routinemassigen Verwendung in den 80er Jahren in den Labors eingefuhrt Labelled Strept Avidin Biotin Methode LSAB Heutzutage ist diese Farbemethode die am meisten eingesetzte Das Prinzip basiert auf der hohen Affinitat von Streptavidin Streptomyces avidinii und Avidin Huhnereiweiss fur Biotin Streptavidin und Avidin besitzen jeweils vier Bindungsstellen fur Biotin Die Reihenfolge der Reagenzien Unkonjugierter Primarantikorper biotinmarkierter biotinylierter Sekundarantikorper Avidin Biotin Enzymkonjugat Substrat Chromogen Farbe Polymer Methoden Hier wird der Primar AK direkte M bzw der Sekundar AK indirekte M mit einem oder mehreren Polymer Molekulen Dextran oder Polypeptid bestuckt Diese Polymere sind markiert mit moglichst viel Enzym das wiederum Substrat und Chromogenumsetzung bewirkt Somit erreicht man eine verstarkte Anfarbung am Ort des Antigens Der Vorteil liegt darin kein Biotin verwenden zu mussen das als endogenes Biotin Hintergrundfarbung verursachen konnte Die Methode ist meist sensitiver und schneller als LSAB Der Nachteil liegt in der Molekulgrosse die ins Gewebe gebracht werden muss und zu sterischen Behinderungen am Bindungsort fuhren kann DoppelimmunmarkierungEine Doppelimmunmarkierung oder Doppelimmunfarbung bezeichnet die Sichtbarmachung zweier Epitope auf einer Untersuchungsprobe durch Verwendung zweier Antikorper oder Immunkonjugate Als Immunkonjugate werden meistens Reporterenzyme radioaktive Isotope kurzlebige a oder b Strahler Kolloide von Edelmetallen oder Fluorophore direkt uber heterobifunktionelle Vernetzer an die Antikorper gekoppelt Die Probe kann z B ein Western Blot Zellen fur eine Durchflusszytometrie ein transmissionselektronenmikroskopisches Praparat oder ein immunhistochemisch oder durch Immunfluoreszenz gefarbter Dunnschnitt sein Die Doppelmarkierung wird auch im Zuge einer virologischen Diagnostik eingesetzt Direkte Farbung Zur Doppelimmunfarbung wird zuerst die Probe mit den beiden gegen zwei verschiedene Epitope gerichteten Antikorpern inkubiert Werden die Antikorper gegen diese Epitope mit jeweils einem Reporterenzym gekoppelt spricht man von einer direkten Markierung Bei einer indirekten Markierung werden die gegen die gesuchten Epitope gerichteten Antikorper als Primarantikorper bezeichnet da anschliessend Immunkonjugate verwendet werden Indirekte Farbung Bei einer indirekten Markierung uber Primarantikorper und Immunkonjugat sind je ein zusatzlicher Waschschritt und eine Immunkonjugat Inkubation notwendig Dafur erfolgt eine Signalverstarkung durch die Verwendung eines Immunkonjugats das gegen mehrere Epitope auf dem F c Fragment des Antikorpers gerichtet ist wodurch viele Reportermolekule am Primarantikorper gruppiert werden Zudem konnen die Immunkonjugate modular gegen alle Primarantikorper einer Art verwendet werden was eine Kopplung jedes Primarantikorpers mit einem Reportermolekul vermeidet und damit Kosten reduziert Werden zwei verschiedene indirekte Farbungen mit getrenntem Primarantikorper und Immunkonjugaten mit Reporterenzymen gleichzeitig verwendet werden zur Unterscheidung der beiden Signale zwei Primarantikorper aus zwei verschiedenen Arten verwendet bei denen die Immunkonjugate nicht kreuzreagieren Dabei werden meistens unterschiedliche Reporterenzyme verwendet Ebenso kann eine serielle Doppelimmunfarbung jedoch auch ausschliesslich mit Peroxidase Konjugaten erfolgen in dem nach einer ersten Farbung die Peroxidase mit verdunnten Natriumazidlosungen inaktiviert wird und anschliessend das ungebundene Natriumazid herausgewaschen und erneut mit einem Peroxidase Konjugat gefarbt wird Reporterenzyme Als Reporterenzyme werden z B die Meerrettichperoxidase mit TMB DAB ABTS AEC oder in Form einer Chemolumineszenz mit Luminol und die Alkalische Phosphatase mit BCIP und NBT oder mit Naphthol AS MX Phosphat und Fast Red TR eingesetzt Die unterschiedlichen prazipitierenden Farbreaktionen werden seriell durchgefuhrt Fluorophore Bei fluoreszenten Mehrfachmarkierungen werden die Fluorophore so ausgewahlt dass die Bereiche der Anregungs und Abstrahlungswellenlangen moglichst weit auseinanderliegen Dadurch wird ein ubermassiges Uberstrahlen der Fluoreszenz in andere Farbkanale des Fluoreszenzdetektors und die damit notwendige Fluoreszenzkompensation gemindert welche zu Verlusten der fuhrt und so die Nachweisgrenze anhebt ReportersystemeDie verschiedenen Farbstoffe unterscheiden sich unter anderem in ihrer Farbe und Loslichkeit Losliche Farbstoffe werden bevorzugt bei einem ELISA eingesetzt wahrend bei der Immunhistochemie und dem Western Blot meist prazipitierende Farbstoffe verwendet werden Peroxidase POD Horseradish peroxidase HRP Der Peroxidase meist der Meerrettichperoxidase wird Wasserstoffperoxid als Substrat angeboten Die freiwerdenden Protonen oxidieren das vorher fast farblose Chromogen zu seinem farbigen Endprodukt unter Bildung von Wasser ABTS AEC 3 Amino 9 ethylcarbazol bildet ein rosenrotes Endprodukt CN 4 Chlor 1 naphthol reagiert unter Bildung eines blauen Farbstoffs DAB 3 3 Diaminobenzidin bildet ein braunes Endprodukt Luminol und andere Dioxetane reagieren unter Bildung von Chemolumineszenz mit folgender Autoradiographie TMB Tetramethylbenzidin bildet ein blaues Endprodukt welches beim Abstoppen der Reaktion mit Schwefelsaure einen stabilen gelben Farbkomplex bildetAlkalische Phosphatase AP Der alkalischen Phosphatase werden organische Phosphatverbindungen als Substrat angeboten Die AP spaltet Phosphat ab und die freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen Endprodukt 5 Brom 4 chlor 3 indoxylphosphat BCIP wird in Verbindung mit Nitroblau Tetrazoliumchlorid NBT zu einem violetten bis blauen Farbstoff umgesetzt Das Tetrazolium Salz oxidiert Indoxyl zum blauen Indigo Farbstoff Dabei wird das Tetrazoliumsalz reduziert zum blauen Formazan Farbstoff Naphthol AS MX Phosphat bildet einen roten Farbstoff Naphthol AS reagiert mit Fast Red TR zu einem unloslichen Azofarbstoff Neufuchsin liefert ein rosa rotes ReaktionsproduktRadioisotope Radioisotope werden im Zuge einer Molekulmarkierung an Antikorper gekoppelt und nach einer Proteinreinigung per Autoradiographie oder per Szintillationszahler registriert 131Iod 32Phosphor 3TritiumSiehe auchCommons Immunohistochemistry Album mit Bildern Videos und Audiodateien In situ HybridisierungLiteraturFriedrich Lottspeich Haralabos Zorbas Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 1998 ISBN 3 8274 0041 4 Hubert Rehm Thomas Letzel Der Experimentator Proteinbiochemie Proteomics 6 Auflage Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2009 ISBN 978 3 8274 2312 2 EinzelnachweiseR Lequin Enzyme immunoassay EIA enzyme linked immunosorbent assay ELISA In Clin Chem Band 51 Nr 12 2005 S 2415 2418 doi 10 1373 clinchem 2005 051532 PMID 16179424